Estudio de las enzimas geraniol 10 - hidroxilasa y P450 reductasa en raíces transformadas de Catharanthus roseus / Blondy Beatriz Canto Canché

Tesis (Doctorado en Ciencias y Biotecnología de Plantas) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2000.

La enzima NADPH: citocromo P-450 reductasa (COR, E.C. 1.6.2.4) es una proteina que reduce a las enzimas citocromo P-450 mono-oxigenasas típicas, las cuales tienen funciones centrales en el metabolismo de los terpenos, alcaloides, flavonoides, fitoalexinas, etc. En la planta Apocynaceae Catharanthus roseus la mono-oxigenasa P-450 geraniol 10-hidroxilasa (G10H, E.C. 1.14.14) participa en la biosíntesis de los alcaloides monoterpén indólicos. Esta enzima parece representar un punto importante en la regulación de la biosíntesis de estos compuestosm en base a que su actividad correlaciona con la producción de dichos metabolitos secundarios. En el presente trabajo se estudia la regulación de la enzima G10H así como la regulación de su reductasa, la enzima CPR. En C. Roseus la CPR es aparentemente codificada por un solo gen y se piensa que posee un única proteína con actividad de CPR. La detección de diversos polipeptidos en las inmunodetecciones de CPR o durante el aislamiento de CPR de C. roseus se han atribuido a degradación proteolitica. En este trabajo se muestra evidencia, apoyada en el uso de antisueros heterólogos, de que la CPR de raíces transformadas de C. roseus es una familia de por lo menos dos péptidos de aproximadamente 87 y 84 kDa, lo que sugiere inmunotipos de CPR tejidos-específicos en esta planta. La actividad de CPR en las raíces transformadas de C. roseus fue inhibida en presencia de la lectina convanavalina A, por lo que es posible de que al menos algunas de la CPRs inmunodetectadas sea el resultado de un procesamiento de glucosilación. Para obtener información sobre la regulación de las actividades de las enzimas G10H y CPR de C. roseus se analizaron sus comportamientos en raíces transformadas que fueron sometidas a tratamientos que provocan la síntesis de alcaloides. Ambas actividades aumentaron cuando las raíces estuvieron en un medio de cultivo libre de fosfatos o cuando se transfirieron a un medio con alto contenido de sacarosa (medio de producción de alcaloides), presentado una regulación coordinada. Sin embargo, con otros tratamientos mostraron una regulación diferencial, ocurriendo un aumento en la actividad de CPR, pero no en la actividad de la G10H, lo que sugiere que la regulación de estas enzimas es compleja. En el presente trabajo se caracterizó un suero contra la G10H de C. roseus. Este antisuero fue capaz de inhibir la actividad de G10H y de reconocer a una proteina de aproximadamente 57 kDa en las preparaciones crudas de microsomas en los que se había detectado la actividad de G10H. El antisuero mostró un resultado negativo con las preparaciones microsomales en las que la actividad de G10H estuvo ausente, tanto C. roseus como de otras especies vegetales. Por lo tanto, este suero puede ser usado para continuar con el análisis de la regulación de esta mono-oxigenasa. Utilizando el suero contra la G10H de C. roseus y el suero contra la PCR de H. tuberosus se obtuvieron algunos resultados sobre la posible regulación espacial de estas proteinas en C. roseus. Los resultados sugieren que la G10H tiene una distribución tejido-específica, mientras que la PCR está presente, y en forma activa, en los diferentes órganos de la planta. También se exploró si las proteinas G10H y la CPR son inducidas con diferentes tratamientos que se han reportado provocan un aumento de los alcaloides monoterpén-indólicos. La proteina G10H y la CPR son inducidas con diferentes tratamientos que se reportaron provocan un aumento de los alcaloides monoterpén-indólicos. La proteina G10H aumentó solamente cuando las raíces se transfirieron a medio de cultivo libre de fosfatos o a mendio de cultivo con 8 por ciento de sacarosa, mientras que la proteina CPR se indujo en estas condiciones y también con la adición de ácido abscísico o zeatina, apoyadndo los resultados obtenidos sobre las actividades, que sugieren que la regulación de éstas enzimas no está estrictamente coordinada.