Estandarización de la técnica de RT-PCR in situ para detectar genes involucrados en el control del ciclo celular en cultivos in vitro de cocotero / Guillermo Alcocer Quian

Tesis (Q.F.B.) .-- UADY. Facultad de Química, 2004.

La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa, con Transcriptasa reversa in situ es una variante de PCR in situ, que en la actualidad está siendo utilizada para la detección y localización de ARN mensajeros en tejidos de diversos organismos incluyendo a las plantas. En el presente estudio se intento estandarizar la técnica de RT -PCR in situ en explantes de plúmulas de cocotero cultivadas in vitro, utilizando el gen del COKA, cuyo producto es una proteína involucrada en el control del ciclo celular. Los resultados mostraron que la técnica de fijación empleada y la impregnación en parafina fueron adecuadas para los tejidos de cocotero. El tiempo óptimo de incubación con Pronasa E fue de 2-3 minutos. La concentración óptima de anticuerpos fue de 6.0 U/mL de TBS 1 por ciento BSA. Sin embargo en los cortes histológicos realizados se encontró mucha señal de fondo en los controles negativos. Ni la adición de mayor concentración de ADNasa I o la utilización de pectinasa disminuyó la señal de fondo en los controles negativos. Sin embargo los resultados de la presente tesis permiten contemplar otras estrategias para realizar la detección in situ de los genes de interés como utilizar DIG-11-UTP marcada con 33fósforo o estandarizar la técnica de hibridación in situ.