Estudio sobre el cultivo in vitro de embriones cigóticos de cocotero (Cocos nucifera L.) / América Amelia Earth Pech y Ake

Tesis (Doctorado en Ciencias y Biotecnología de Plantas) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2004.

El cocotero ha sido por mucho tiempo un cultivo importante en las zonas tropicales, tanto desde un punto de vista económico como de subsistencia para millones de habitantes del trópico. En los últimos años el cocotero ha disminuido sus volúmenes de producción debido a que se tienen plantaciones antiguas, con poca atención y atacadas por condiciones adversas como ciclones, enfermedades y plagas. El problema se agrava porque la utilización del cocotero está dirigida principalmente a la obtención de copra para la producción de aceite, que está siendo desplazado en el mercado mundial por aceite de palma aceitera. Es urgente hacer una replantación con nuevos materiales que actualmente no están disponibles ni en la cantidad ni en la calidad que se demanda. Se requiere evaluar y seleccionar nuevo germoplasma de cocotero, por medio de un intercambio seguro entre los países productores. Para este propósito, la técnica de cultivo in vitro de embriones cigóticos de cocotero ha sido recomendada por FAO / IBPGR para el transporte de germoplasma (Frison, et al., 1993). En la presente tesis se decidió realizar estudios que ayudaran a establecer las bases para explicar porque hay ventaja en el uso de medio sólido, en la orientación del embrión y si esto tenía que ver con respiración aeróbica. Por otro lado, puesto que el trabajo tenía como propósito general contribuir a mejorar la tecnología de cultivo in vitro de embriones, también se estudio si las fitohormonas ácido giberélico (GA3) o el ácido abscísico (ABA), podían favorecer la germinación y el desarrollo post-germinativo; si la adición al medio de soportes inertes favorecía el desarrollo de las raíces; y definir el grado de desarrollo que las plántulas deben de alcanzar en condiciones in vitro que les permitan sobrevivir exitosamente al ser transferidas a condiciones ex vitro. Para los estudios se utilizaron embriones de la variedad Enano Malayo Verde (EMA) con una edad fisiológica de 12-14 meses después de polinización y el medio de cultivo fue Y3 con la adición de carbón activado y gel-rite como agente gelificante. Se estudio comparativamente el uso de medio con (sólido) y sin (líquido) gelificante. Los mejores resultados en germinación y conversión fueron obtenidos en medio sólido (87 por ciento y 82 por ciento respectivamente) superando notablemente a los obtenidos usando medio líquido (66 por ciento y 46 por ciento respectivamente). Estos resultados se obtuvieron cuando los embriones fueron sembrados en la superficie del medio sólido en posición vertical con el micrópilo hacia arriba, es decir cuando están expuestos a la fase gaseosa del ambiente de la atmósfera en el vial. Posteriormente se realizaron estudios en los que los embriones fueron sembrados en diferentes formas exponiéndolos o no al aire, mediante la sustitución del aire por N2 o N2/O2, así como también evaluando el efecto de inhibidores de la respiración aeróbica sobre la germinación. De esta forma se obtuvo evidencia que demuestra que la germinación de los embriones de cocotero es dependiente de la respiración aeróbica. También se pudo demostrar que estás condiciones de germinación favorecen el desarrollo post-germinativo. Para el caso particular de raíces, se evaluó la adición de medio líquido a soportes inertes: agrolita, vermiculita ó fibra de coco (cocopeat). Los resultados obtenidos con los soportes fueron inferiores a los obtenidos con medio líquido sin soporte. Por otro lado, se evaluó el empleo de extensiones (isopropileno isotáctico) en los contenedores, lo que permitió un incremento en el desarrollo de las plantas de un 35 por ciento en la talla y una mejor apariencia. Se determinó que grado de desarrollo deberían de alcanzar las plántulas para lograr una transferencia exitosa a condiciones ex vitro, el punto óptimo es cuando ya formaron tres hojas bífidas y tres raíces primarias, con lo que se puede obtener cerca de 100 por ciento de sobrevivencia en estas condiciones. Por otro lado, aunque los resultados mencionados arriba en germinación, conversión a plántulas totales fueron buenos, adicionalmente se probó el empleo de fitohormonas para mejorarlos aún más. El grado de desarrollo de los embriones en una colecta no es homogéneo pues entre otras cosas se efectúa cada tres o cuatro meses, por lo cual con el objetivo de sincronizar la germinación de los embriones e incrementar el porcentaje de germinación se evaluó el uso de ASA (solo o en combinación con PEG) y GA3. La aplicación de ASA (solo o en combinación con PEG) al medio (sólido) en las diferentes concentraciones usadas tuvo siempre un efecto negativo en la germinación de los embriones. Cuando se aplicó GA3 al medio de cultivo, los porcentajes de germinación aumentaron en medio sólido. de 87 por ciento a 98 por ciento y en líquido de 62 a 80 por ciento. Las concentraciones de GA3 aplicadas fueron de 4.6 I.JM para el medio sólido y 0.46. I.JM de GA3 para el medio líquido. Esta fitohormona fue aplicada durante las primeras cuatro primeras semanas de cultivo de los embriones en condiciones de oscuridad, después de este tiempo estos fueron transferidos a un medio líquido libre de GA3 para su subcultivo. Los resultados también mostraron un efecto post-germinativo, incrementándose los porcentajes de conversión y obteniéndose plántulas completas, lo cual permitió lograr un mayor número de plántulas con las características adecuadas para su transferencia a condiciones ex vitro, obteniéndose un 100 por ciento de sobrevivencia. Las características morfológicas de las plántulas obtenidas con el tratamiento de GA3 fueron mejores que cuando no se usa la fitohormona. Los tiempos de germinación de los embriones cigóticos se lograron reducir con el uso de medio sólido, pero fueron aún más cortos cuando a este medio se le adicionó GA3´ Considerando los resultados en esta tesis, se propone un protocolo que incluye las mejores condiciones para la geminación y el desarrollo post-germinativo de los embriones cigóticos de cocotero: Para su germinación los embriones se deben cultivar por cuatro semanas en la superficie de medio sólido conteniendo GA3 4.6 I.JM, en posición vertical con el extremo del micrópilo orientado hacia arriba expuesto a la atmósfera de aire del contenedor. Posteriormente se deben transferir a medio líquido para su conversión. Se requiere poner extensiones de isopropileno isotáctico a los contenedores, las cuales además de proporcionarles espacio adicional, permiten el intercambio de gases aunque no la pérdida de agua, redundando en un mejor desarrollo de las plantas. La transferencia a condiciones ex vitro deberá de efectuarse cuando las plántulas hayan formado tres hojas bífidas y tres raíces primarias al menos.