Amplificación rápida de los extremos terminales (race 3´ y 5´) del gen de la fosfolipasa C en células de cafeto en suspensión / William Israel Ayuso Cano

Tesis (Q.F.B.) .-- UADY. Facultad de Química, 2006.

El conocimiento de la secuencia de bases que codifica una molécula de una proteína funcional representa un gran avance para la ciencia básica pues, a pesar de ocupar un pequeño espacio en el cromo soma, contiene suficiente información de la que se derivan respuestas para una gran variedad de preguntas como por ejemplo: ¿ Cuál es el origen de algunas enfermedades hereditarias?, ¿Por qué algunos organismos tienen características diferentes en su desarrollo?, ¿Por qué unos organismos son inmunes a enfermedades y otros no? La importancia de este conocimiento radica en la aportación de las herramientas necesarias para resolver los problemas que se presentan para una mejor manera de sobrevivencia. El presente trabajo se refiere a una de las estrategias establecidas para el conocimiento de la secuencia de un gen; particularmente, el gen que codifica una enzima que se encuentra involucrada en algunos procesos celulares de las plantas. Se utilizó la técnica conocida como Amplificación rápida de los extremos terminales (RACE por sus siglas en inglés; Rapid Amplification of cDNA Ends) para completar la secuencia de un gen de la fosfolipasa C (PLC) de células en suspensión de cafeto. Se sintetizó el ADNc por transcripción reversa a partir de ARN total de células en suspensión de 14 días de cultivo. La síntesis del ADNc se realizó incluyendo secuencias de nucleótidos conocidas tanto en el extremo 5´ como en el 3´ que posteriormente se utilizaron como sitio de anclaje para .1os cebadores específicos. La Amplificación se realizó por la PCR utilizando cebadores (en sentido y antisentido) específicos para la fosfolipasa C en combinación con un cebador (en sentido y antisentido) específico para la secuencia ligada al ADNc sintetizado. En los experimentos para la amplificación rápida del extremo 5´, se obtuvo la amplificación de un fragmento de aprox. 1100 pb cumpliendo nuestras expectativas. Este fragmento se clonó, se analizó y actualmente se encuentra en secuenciación. En relación a los experimentos de RACE 3´, no se obtuvieron resultados favorables.