Estudios preliminares de transformación genética de cocotero (Cocos nucifera L.) cv. Alto del Atlántico mediante Agrobacterium tumefaciens / José Efraín Ramírez Benítez

Tesis (Maestría en Ciencias y Biotecnología de Plantas) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2005.

El cultivo de cocotero (Cocos nucifera L.) en nuestro país enfrenta en la actualidad diversos problemas, principalmente la pérdida de superficie cultivada debido a la ocurrencia de enfermedades como el amarillamiento letal (AL). Con el objetivo de contribuir en la búsqueda de opciones de solución a tal problemática, se están realizando estudios en las áreas de micropropagación in vitro, interacción planta-patógeno, genética, genómica y mejoramiento gen ético Qel cocotero. Para realizar análisis más profundos de los mecanismos involucrados en estos procesos es necesario el desarrollo de herramientas tales como un sistema de transformación genética para cocotero. El objetivo del presente trabajo fue establecer una metodología para la obtención de células transformadas de cocotero cv. Alto del Atlántico, mediante la infiltración al vacío con Agrobacterium tumefaciens. Se utilizó la cepa hipervirulenta EHA 101 de A. tumefaciens, conteniendo el plásmido binario pLH60-RFP, el cual porta el gen marcador dsred (proteína roja fluorescente) y el gen selectivo hptll (higromiclna fosfotransferasa) en su T -DNA. Células con fluorescencia roja fueron observadas en secciones de callos infiltrados (!!..p = -600 mm Hg durante 15 min) con cultivos de EHA101 ::pLH60-RFP (107 ufc/ml) y cocultivados por 3 días. La fluorescencia se mantuvo en grupos dispersos de células de los callos cocultivados a los 60 días posteriores al cocultivo. Los callos cocultivados presentaron obscurecimiento generalizado después de cultivarse durante 8 días en medio Y3 suplementado con 80 mg/L de una mezcla de ticarcilina:clavulanato (30: 1). La amplificación de los genes virG y dsred en extractos de ADN de callos de cocotero presentando fluorescencia roja sugieren la presencia de A. tumefaciens en los callos cocultivados después de su cultivo en medios con ticarcilina:clavulanato:A su vez, se determinó que la incubación de callos en medio Y3 sólido adicionado con 20 mg/L de higromicina durante 15 días inhibe el crecimiento y causa obscurecimiento, mientras que un mayor tiempo de exposición tiene como consecuencia la necrosis de los explantes. Es necesario considerar algunas modificaciones al protocolo con el objetivo de aumentar la eficiencia de transformación como son: tratamiento de los explantes con compuestos antioxidantes, uso de cepas bacterianas más sensibles a antibióticos y el empleo de menores concentraciones de ticarcilina: clavulanato para la eliminación de EHA101.