Transformación genética de tejido meristemático (escalpos) de banano cv "Enano gigante" con el gen WUSCHEL de Arabidopsis thaliana mediante infiltración al vacío / Suemy Terezita Echeverría Echeverría

Tesis (Maestría en Ciencias y Biotecnología de Plantas) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2007.

La embriogénesis somática (ES) y la transformación genética tienen un papel fundamental en el mejoramiento genético y la propagación clonal del banano. La ES es una técnica ya probada en banano, pero la baja eficiencia del proceso en los distintos sistemas, -del 2 al 5 por ciento de los explantes tiene una respuesta embriogénica positiva-. conlleva a la búsqueda de nuevas alternativas. En este sentido, en otros sistemas como Arabidopsis thaliana, se ha observado una respuesta favorable de los tejidos a la formación de embriones somáticos cuando el gen WUSCHEL (WUS) es sobreexpresado, ya que se sabe esta implicado en definir la identidad de las células madres. En el presente trabajo se realizó la transformación genética de bajano con un gen heterólogo, el gen WUS, con el objetivo de probar si la expresión de este modifica de alguna manera la respuesta embriogénica de los explantes y/o acorta el tiempo de inducción in vitro. Para ello, los explantes de yemas en prolifereación, denominados "escalpos", de los cultivares Enano gigante (EG, genotipo AAA) y Manzano (MZN, genotipo AAB) se transformaron con el gen WUS bajo el control del promotor GAL4 inducible por 17B-estradiol, mediante infiltración al vacío con Agrobacterium tumefaciens. La transformación de los explantes fue exitosa, hecho que se verificó mediante pruebas de PCR utilizando nucleótidos específicos para el gen de selección de la neomicina fosfotransferasa II (NPTII) y el gen WUS. Al mismo tiempo, los tejidos positivos fueron proliferados y analizados mediante microscopía de fluorescencia, confirmandose la expresión de la proteína roja fluorescente (RFP) en los tejidos transformados y no así en los controles. Por otra parte, se realizaron experimentos encaminados a evaluar el efecto de los esteroides 17B-estradiol (Bst) y 22(S), 23 (S)-homobrasinólido (HomoBra) sobre el proceso de embriogénesis somática de EG, dada la presencia del promotor inducible por estrógeno en el constructo con que se transformó escalpos de banano. Para ello los escalpos no trans-formados fueron inducidos al proceso de embriogénesis somática en un medio ZZ adicionado con auxina y citocina, y se probaron diferentes concentraciones de Bst (0.05, 0.1, 0.5, 1.0 y 5.0 uM) y HomoBra (0.05 y 0.5 uM). En el medio ZZ cerca del 8 por ciento de los explantes formó callo embriogénico ideal, dicho valor no difiere significativamente de la respuesta del 12.5 por ciento observada en los tratamientos con esteroides, pero en su conjunto presenta 2 veces el valor reportado en la literatura. Asimismo, se evidenció que la respuesta del tejido a la formación de callo embriogénico en presencia de ambos esteroides, fue más rápido es decir, casi la mitad (45 días) del tiempo reportado en la literatura (3-5 meses). Se indujo también la proliferación de lose scalpos en medio basal (P4) probándose diferentes concentraciones de disolvente DMSO y etanol (0.05 por ciento y 0.1 por ciento), así como de Bst y HomoBra. Los resultados mostraron que una mayor proliferación y poca necrosis del tejido con 5.0 uM Bst y 0.5uM HomoBra, en tando que la concentración de 0.1 por ciento para ambos disolventes no causó necrosis total del tejido. Además se indujo la respuesta embriogénica en los explantes transformados en un medio ZZ en presencia de esteroides, obteniendose un resultado de 6.7 veces mayor respuesta embriogénica en los tejidos de EG transformados respecto a lo reportado en la literatura. Sin embargo en un medio con baja concentración de auxinas la respuesta se dirigió hacia la vía de organogénesis.