Clonación y caracterización de la expresión del gen LYS2 en Mycosphaerella fijiensis / Nuvia Eugenia Kantún Moreno

Tesis (Maestría en Ciencias y Biotecnología de Plantas) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2008.

En la mayoría de los países bananeros, incluyendo México, la enfermedad conocida como Sigatoka negra es el principal problema fitosanitario que afecta a los cultivos de bananos y plátanos. Para diseñar estrategias de control contra esta enfermedad es necesario estudiar y conocer mejor al patógeno. La identificación de compuestos claves en la vida y virulencia del patógeno es una estrategia de control que debe de explorarse. Algunas enzimas involucradas en la biosíntesis de aminoácidos son esenciales en el crecimiento y en la virulencia de los patógenos. La a-aminoadipato reductasa codificada por el gen L YS2 cataliza un paso clave y único en la biosíntesis fúngica de lisina. Además L YS2 es exclusivo de hongos superiores, por lo que podría ser un blanco molecular en el diagnóstico de la enfermedad y posiblemente para control de la Sigatoka negra. En este trabajo se aisló el AONc de L YS2 de M. fijiensis a partir de micelio cultivado en medio mínimo libre de aminoácidos y se caracterizó la expresión de L YS2 en micelio cultivado tanto en medio nutritivo (POB) como en medio mínimo con y sin lisina. Previo a este trabajo y empleando oligonucleótidos degenerados se aisló un fragmento de 734 pb cuyo análisis por Blastx indicó ser parte de L YS2 de M. fijiensis. Esta secuencia sirvió de anclaje para aislar los extremos faltantes 5´ y 3´ del AONc de M. fijiensis, los cuáles se obtuvieron mediante la técnica GeneRacer. El AONc completo de L YS2 de M. fijiensis consiste de 3,882 pb, siendo la región codificante de 3,561 pb que codifican 1,187 aa; la secuencia deducida de aminoácidos de M. fijiensis tiene un 56 por ciento de identidad con Lys2p de A. fumiga tus. En la proteína deducida Lys2p de M. fijiensis se identificaron todos los dominios funcionales conservados en las a-aminoadipato reductasas. Se encontró que la divergencia entre las proteínas Lys2p de los hongos filamentosos se encuentra principalmente en el extremo amino. Mediante RT -PCR, se observó que L YS2 se expresa en micelio cultivado tanto en medio mínimo como en medio POB, pero también se detectó en micelio cultivado en medio mínimo adicionado con lisina; por tanto la lisina no reprime la expresión de L YS2 en M. fijiensis como ocurre en otros hongos. Asimismo, se obtuvieron conidios de M. fijiensis en medio mínimo con y sin lisina a pH 6; lo que muestra que el medio mínimo es capaz de inducir la esporulación del hongo. Este material permitirá explorar si L YS2 se expresa en el estadio de conidio en M. fijiensis.