Generación de un vector para la transformación genética de cloroplastos en Cedro rojo (Cedrela odorata L.) / Max Mizraim Apolinar Hernández

Tesis (Maestría en Ciencias Biológicas : Opción Bioquímica y Biología Molecular) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2011.

La transformación de cloroplastos surge como una alternativa para realizar mejoramiento gen ético en plantas, por las ventajas que ofrece sobre la transformación de núcleos, por ejemplo: se evita el flujo génico debido a la estricta heredabilidad materna de los cloroplastos en la mayoría de las plantas, se pueden insertar operones completos bajo el control de una sola secuencia regulatoria (policistrones), se obtienen altos niveles de expresión y alta estabilidad de los transgenes porque no hay silenciamiento génico ni efecto de posición, esto último debido a que la integración ocurre por recombinación homóloga (RH) en sitios específicos del plastoma. Para lograr una RH que conduzca a una alta eficiencia de transformación, es necesario construir vectores especie-específicos. Una de las secuencias más utilizadas para flanquear a los casetes de expresión en dichos vectores, es la región ocupada por el/oci rrn16S-trnl-trnA-rrn23S. El cedro rojo (Cedrela odorata L.) es una especie forestal tropical perteneciente a la familia de las meliáceas, de importancia comercial debido al alto valor que alcanza su madera. Uno de los problemas que afectan al cedro es el ataque por el insecto barrenador de las meliáceas (Hypsipyla grandella), que produce daño apical dando como resultado la bifurcación del tallo del árbol, haciéndolo inadecuado para su comercialización, lo cual ha afectado el desarrollo de plantaciones comerciales en el sureste de México. La transformación de cloroplastos de cedro con genes que confieran resistencia a insecto podría resolver esta problemática. Por ello se planteó el objetivo de construir un vector para la transformación de cloroplastos de cedro, que posteriormente podrá ser utilizado para la obtención de resistencia a H. grandella. Se diseñaron oligonucleótidos, a partir de secuencias heterólogas disponibles en las bases de datos, para amplificar un fragmento de 5.7 kb de la región 16S-trnl-trnA-23S del plastoma de cedro, esta región se clonó en el vector pUC19. En la región intergénica trnl-trnA de la secuencia, se insertó un casete de expresión que contiene el gen aadA, que codifica la aminoglucósido 3´adeniltransferasa que confiere resistencia a espectinomicina y el gen que codifica la proteína verde fluorescente, bajo la regulación de secuencias promotoras y UTR´s que permiten su expresión en tejidos con plástidos verdes así como no Fotosintéticos. La secuencia 16S- trnl-trnA-23S de cedro mostró un 99 por ciento de identidad con las secuencias de Mangifera indica L. , Citrus sinensis y Theobroma cacao, abriendo la posibilidad de utilizar este vector de transformación en estas especies de importancia económica.