Estudio de genes que codifican proteínas de pared celular del hongo Mycosphaerella fijiensis / Nuvia Eugenia Kantún Moreno

Tesis (Doctorado en Ciencias Biológicas : Opción Biotecnología) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2012.

El hongo hemibiotrófico Mycosphaerella fijiensis afecta al banano (Musa spp.), uno de los cultivos agrícolas más importantes en el mundo. La Sigatoka negra es la enfermedad causada por dicho hongo y está presente en la mayoría de las plantaciones de bananos en el mundo. Se conoce poco de los genes que son importantes para la patogénesis de M. fijiensis. Un área atractiva de estudio en la identificación de estos genes es la pared fúngica, ya que esta estructura es única en el reino Fungi y contribuye al mantenimiento de la homeostasis celular. Además, la pared es la estructura más externa que protege a la célula fúngica y media la interacción de éste con su huésped, el banano. En hongos Ascomycota se han identificado proteínas de pared importantes en la viabilidad y virulencia fúngica: proteínas con anclaje GPI y con repeticiones internas (Pir). En el año 2007, el Join Genome Institute terminó la secuenciación del genoma de M. fijiensis. Empleando esta base de batos identificamos in silico 49 proteínas GPI y 4 proteínas que presentaron similitudes con las proteínas Pir (Pir-like). De esta lista, se seleccionaron tres genes para el análisis de la expresión y de función. La selección se realizó con base en su homología con genes de patogénesis: homología con DCW1 (oc-l,6-manosidasa) y GAS1 y GAP1 (|3-1,3-glucosiltransferasas) de Fusarium sp. Estos genes fueron nombrados MfDCWI, MfGASI y MfGAS2, respectivamente. La expresión de los genes MfGAS2 y MfDCWI mostró variación en el hongo cultivado en diferentes medios de cultivo in vitro; durante las diferentes etapas de su desarrollo (conidio o micelio) y también durante el proceso infectivo del banano. Por el contrario, la expresión de MfGASI se observó casi constante, con poca variación en los conidios y en la etapa de pizca en la fase necrotrófica de la enfermedad. Mediante análisis bioinformáticos se seleccionaron regiones de los genes MfDCWI, MfGASI y MfGAS2 para llevar a cabo su silenciamiento mediante ARNi. Los fragmentos seleccionados fueron amplificados y clonados en el vector pSilent-1, generándose los constructos nombrados respectivamente pSilent-MfDCW1-SA (7373 pb), pSilent-MfGAS1-SA (7362 pb) y pSilent-MfGAS2-SA (7370 pb). Se realizaron ensayos de transformación de M. fijiensis utilizando el vector pAN7.1, con el fin de establecer el protocolo. La transformación de este hongo ha sido difícil; en este trabajo no se logró transformarlo de manera eficiente y reproducible. Nuestro grupo de trabajo continuará con la estandarización de la transformación de M. fijiensis con el fin de tener la capacidad de realizar los análisis de función de los genes de interés. Este es el primer trabajo en la familia Mycosphaerellaceae que identifica y estudia genes que codifican proteínas de la pared celular en uno de sus miembros.