Caracterización del promotor del gen CrGPDH3 de la microalga verde Chlamydomonas reinhardtii y su potencial para conducir la expresión de un gen reportero de manera inducible / Anayeli Guadalupe Beltrán Aguilar

Tesis (Maestría en Ciencias Biológicas : Opción Biotecnología) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2013.

La microalga verde Chlamydomonas reinhardtii es considerada una plataforma atractiva sara la producción de proteínas recombinantes, debido a su cultivo fácil, económico y su gran capacidad para acumular biomasa. Recientemente se ha despertado el interés en la jtiltdad de promotores inducibles para conducir la expresión de genes recombinantes en el núcleo de esta miroalga. También se han identificado genes homólogos a glicerol-3-Ibsfato deshidrogenasa (GPDH) en C. reinhardtii, y se observó que la expresión de CrGPDH3 fue inducida en respuesta a estrés osmótico por 200 mM de NaCI por dos horas. Por lo tanto, resulta atractivo determinar el potencial del promotor del gen CrGPDH3 para conducir la expresión de un gen reportero de manera inducible. La expresión del gen CrGPDH3 se evaluó por RT-PCR bajo 5, 50, 100 y 200 mM de NaCI a diferentes tiempos (5, 30, 60 y 120 minutos) y se encontró que la expresión de este gen se induce bajo todas estas concentraciones a partir de los 5 minutos de exposición alcanzando el punto de expresión de la PCR a partir de una hora. Por otra parte, se elaboraron tres construcciones de expresión que contenían tres fragmentos de diferente longitud correspondientes a la región del promotor más la región 5´ no traducible (5´ UTR) del gen CrGPDH3 (promA, promB y promC) que incluyen al gen reportero uidA, y una secuencia terminadora del gen RBCS2 de C. reinhardtii, y con ellas se transformó a C. reinhardtii mediante biobalística. Se evaluó la expresión del gen uidA en tres clonas individuales de C. reinhardtii transformadas con la construcción que contenía promA, y se encontró que esta secuencia fue capaz de conducir la expresión de este gen tanto en las muestras tratadas como no tratadas con 50 mM de NaCI. Posteriormente, se evaluó la expresión del gen uidA en un "pool" de nueve clonas transformadas con las construcciones que contenían ya sea promA, promB ó promC, y se observó que las tres secuencias de CrGPDH3 fueron capaces para dirigir la expresión de este gen tanto en las muestras tratadas como no tratadas con 100 mM de NaCI. Por tanto, una secuencia de 938 pb que incluye el 5´ UTR de CrGPDH3 fue suficiente para conducir la expresión del gen reportero uidA. Sin embargo, será necesario continuar la investigación del promotor de CrGPDH3, para determinar si existe alguna secuencia río arriba que esté relacionada con la inducibilidad en presencia de NaCI, así como para incrementar los niveles de expresión obtenidos