Desarrollo de un protocolo para la construcción de una biblioteca genómica BIBAC de banano (Musa spp) /
Leticia Peraza Echeverría
- 93 p. : il. ; 23 cm.
Tesis (Maestría en Ciencias y Biotecnología de Plantas) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2003.
Los bananos y plátanos representan un cultivo de gran importancia, principalmente en los países pobres de África central y este de Asia, ya que es un alimento básico. Además, es una importante fuente de divisas en América Latina y el Caribe. Sin embargo, este cultivo es amenazado por plagas y enfermedades que causan cuantiosas pérdidas en el rendimiento, y por consecuencia en las ganancias, afectando con esto a pequeños y a grandes productores. Aunque se han desarrollado programas de mejoramiento para la producción de híbridos resistentes a las principales enfermedades, no se ha obtenido a la fecha ningún banano o plátano que cubra los requerimientos necesarios que exige el mercado internacional, en respecto como por ejemplo, la palatabilidad y la fisiología postcosecha. Es una necesidad entonces, el buscar nuevas alternativas para la obtención de plantas resistentes de banano que mantengan las características originales de palatabilidad, tamaño de racimo y el tiempo de almacenamiento, por ejemplo. Una alternativa que puede ser utilizada como herramienta para el aislamiento de genes de interés (como los de resistencia a enfermedades), es la construcción de bibliotecas genómicas con insertos de ADN de gran tamaño (en promedio mayor que 100 kb) a partir de especies resistentes a enfermedades y utilizando vectores binarios los cuales pueden ser mantenidos en E coli y A tumefaciens. Para seguidamente transferir una resistencia parcial o total a variedades susceptibles de importancia económica, a través de la transformación mediada por Agrobacterium. Esta herramienta no solo podrá ser utilizada para el aislamiento de genes, sino también para el estudio completo del genoma del género Musa, del cual se conoce muy poco. En el presente trabajo se seleccionó al banano silvestre diploide Musa acuminata ssp burmannicoides tipo Calcutta 4 como material biológico para establecer las condiciones óptimas para la construcción de una biblioteca genómica BIBAC, debido a que este banano es la principal fuente de resistencia contra la Sigatoca negra y es utilizado en los programas de mejoramiento convencional. El vector utilizado para la clonación fue de tipo cósmido binario, denominado pCLD04541, el cual tiene un tamaño de 29 kb. El vector pCLD04541 fue purificado utilizando dos gradientes de cloruro de cesio, posteriormente se linearizó con la enzima BamHI o Hindlll y se desfosforiló. Se aislaron núcleos de hojas jóvenes obtenidas de plantas ex vitro y se incluyeron en agarosa de bajo punto de fusión formando bloques, los cuales fueron digeridos con proteinasa K para liberar al ADN y exponerlo a una digestión parcial con la enzima BamHI o Hindlll, ensayando previamente diferentes concentraciones de cada una para determinar las concentraciones óptimas a las cuales se obtenían fragmentos de ADN entre 100 Y 400 kb. Para la obtención de estos últimos se procedió de dos formas: 1) realizando una primera y única selección de fragmentos de ADN, y 2) efectuando primera y segunda selección de fragmentos de ADN. El vector linearizado fue ligado de manera independiente con los fragmentos tanto de F1 (100-250 kb) como de F2 (250-400 kb) siguiendo una relación molar 1:2 ó 1:4 (inserto:vector). Se electroporaron 20 uI de células competentes DH10B usando 1.5 ó 2 uI de ligación y se plaquearon en medio selectivo LB con tetraciclina, IPTG y X-GAL; después de 24 h se determinó el número de colonias recombinantes (blancas). Posteriormente, a fin de caracterizar las ligaciones obtenidas en cuanto al tamaño de inserto y el número de colonias con vector sin inserto (clonas vacías) se analizaron colonias al azar (de F1), aislando el ADN recombinante mediante mini preparación y digiriéndolo con la enzima Notl para liberar al inserto y determinar su tamaño promedio. Se seleccionaron dos ligaciones, una proveniente de las fracciones digeridas con BamHI, con un tamaño promedio de inserto de 125 kb Y la otra ligación proveniente de fragmentos digeridos con Hindlll, con un tamaño promedio de inserto de 122.27 kb. Con estas ligaciones se pueden construir dos bibliotecas genómicas BIBAC del banano Calcutta 4 correspondiente a 10x el genoma haploide, con un 99 Por ciento de probabilidad de encontrar cualquier gen de interés. Estas serán las primeras bibliotecas de banano construidas con un vector binario, por lo que, los insertos estarán listos para ser utilizados en la transformación genética de plantas mediante Agrobacterium.
BIBLIOTECA GENOMICA BIOTECNOLOGIA AGRICOLA BIOTECNOLOGIA VEGETAL MEJORAMIENTO SELECTIVO DE LAS PLANTAS PLATANO--BIOTECNOLOGIA PLATANO--MICROPROPAGACION