Estudio de la enzima 10-oxogeranial ciclasa de raíces transformadas de Catharanthus roseus / Patricia Guadalupe Sánchez Iturbe

Tesis (Doctorado en Ciencias y Biotecnología de Plantas) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2004.

La enzima 10-oxogeranial: iridodial ciclasa (10-0C), que cataliza la reacción de formación de iridodial a partir de 10-oxogeranial y NADPH, se encuentra presente en células de plantas, ha sido detectada en células de cultivos de células en suspensión de Rauvolfia serpentina y en cultivos de raíces transformadas de Catharanthus roseus. En general, no existen estudios que permitan evaluar la(s) función(es) específica(s) de la 10-0C en la biosíntesis de los alcaloides monoterpeno indólicos; sin embargo, su actividad es detectable y por las características de la reacción que cataliza, es probable que pueda ser un punto de regulación en esta ruta metabólica. En este trabajo se identificó, semipurificó y caracterizó a la enzima 10-0C presente en extractos solubles de raíces transformadas de C. roseus. En la primera parte de este trabajo se estableció una metodología para la preparación del sustrato verdadero de la enzima, el 10-oxogeraniol. Este compuesto de origen terpénico, el cual no se encuentra comercialmente disponible se obtuvo mediante la doble oxidación química del 10-hidroxigeraniol empleando como oxidante al reactivo de Corey, (clorocromato de piridinio), en una relación 4:1 monoterpeno:oxidante, permitiendo la oxidación durante 30 minutos. Bajo estas condiciones se obtuvo al 10-oxogeraniol el cual fue purificado posteriormente por cromatografía en columna. La identidad del compuesto fue determinada por 1H-RMN. El sustrato así obtenido permitió establecer una metodología para detectar y caracterizar a la enzima. Durante un ciclo de cultivo de células de raíces transformadas de C. roseus, obtenida en un curso temporal de 21 días, se observó una actividad enzimática exclusivamente soluble que se mantuvo constante (1,200 pKat mg-1) durante O a 9 días; posteriormente tuvo algunas variaciones para alcanzar después un pico máximo de actividad en el día 21 (1,700 pKat mg-1). Después de varios intentos, se estableció una estrategia para purificar a la enzima basada en cromatografía de exclusión por tamaño y en cromatografía de afinidad. Se alcanzaron 19.6 veces de purificación a partir del extracto crudo, teniendo como producto final en el gel SDS algunas bandas mayoritarias en el rango de 60 y 35 kDa. El pH óptimo para la reacción catalizada por la enzima semipurificada fue 7.0 y el pl fue aproximadamente 5.4. También se hicieron algunos experimentos iniciales para caracterizar cinéticamente a la enzima, obteniéndose los valores de KM para el 10-oxogeranial y el NADPH y que fueron 0.52 mM y 70 IJM, respectivamente. Estos resultados deben servir como antecedente para futuros trabajos para purificar totalmente a la enzima, conocer su mecanismo de reacción y para puntualizar aspectos relacionados con su función.