Establecimiento de protocolos de solubilización con detergente y purificación por cromatografía de afinidad de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril -CoA reductasa de raíces transformadas de Catharanthus roseus (L.) G. Don / Luis Carlos Gutiérrez Pacheco

Tesis (Maestría en Ciencias y Biotecnología de Plantas) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2000.

La enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGR) (EC 1.1.134) cataliza la síntesis del ácido mevalónico, a partir del cual, después de una serie de pasos enzimáticos, se forma el isopentenil pirofosfato (IPP), unidad principal de construcción que da lugar a toda la serie de compuestos isoprénicos que intervienen en múltiples procesos bioquímicos de las plantas. En células de mamíferos, la HMGR es la enzima clave en la regulación de la biosíntesis de hormonas, fitoalexinas y metabolitos secundarios como los alcaloides monoterpén-indólicos. En Catharanthus roseus se sintetiza un monoterpeno, la secologanina, el cual al condensarse con la triptamina produce la estrictosidina, alcaloide a partir del cual se sintetizan la serie completa de estos compuestos en las Apocinaceas. Dado que la HMGR no es monogénica en las plantas, existe la posibilidad de que se encuentre más de una isoenzima. El objetivo de este proyecto fue poner a prueba esta hipótesis. Para ello iniciamos la purificación de la HMGR membranal de raíces transformadas de Catharanthus roseus. Como pasos previos, se estandarizaron parámetros útiles para el proceso de purificación, tales como el tiempo y la concentración de proteinas necesarios para la reacción enzimática y cuyos valores óptimos fueron 10 minutos y 9 uL de volúmen de extracto vegetal (32.4 ug de proteína); la estabilidad enzimática de la HMGR a 4°C, que fue de 36 horas. Dado el carácter membranal de la HMGR, se ensayaron varios métodos de solubilización y los mejores resultados se obtuvieron con la congelación del extracto enzimático y su posterior incubación con 6 por ciento de detergente no iónico Brij W1 durante 30 minutos a 35° centigrados, y la aplicación de una doble centrifugación a 190,000xg. Para el proceso cromatográfico, se utilizó una columna de azul de sefarosa, de la que se eluyó la HMGR con un cambio instantáneo de concentración de KCI, lo que permitió purificar 5.26 veces la HMGR a partir del extracto enzimático solubilizado y con una actividad específica de 7.67 pkat mg-1 prot. El resultado obtenido de la electroforesis en un gel desnaturalizante sugiere que la HMGR de C. roseus podría estar compuesta de 4 subunidades de 50 kDa. Posteriormente se preparó una columna de afinidad de HMG-CoA sefarosa. Los resultados obtenidos en este trabajo mostraton la dificultad para purificar la HMGR; sin embargo, se estandarizaron los protocolos de la extracción, solubilización y estabilización de la enzima.