Fosforilación de proteínas en residuos de tirosina en raíces transformadas de Catharanthus roseus (L.) G. Don / Luis Carlos Rodríguez Zapata

Tesis (Doctorado en Ciencias y Biotecnología de Plantas) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 1998.

La percepción y transmisión celular de señales externas se lleva a cabo a través de receptores específicos que se encuentran en la membrana plasmática. La transmisión de la señal externa se inicia con la unión de una molécula señal (ligando) con su respectivo receptor. Una vez que el receptor ha sido activado se inicia una serie de reacciones intracelulares que regulan respuestas determinadas. Tales respuestas están controladas por diferentes mecanismos; uno de los más importantes es la fosforilación de proteínas. Tanto en procariontes como en eucariontes, se sabe que la fosforilación de proteínas tiene una función importante en la regulación de procesos involucrados en la transducción de señales, así como en la regulación de actividades enzimáticas. Las proteínas pueden fosforilarse en residuos de treonina, serina, histidina y tirosina. El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia de la fosforilación en residuos de tirosina en células vegetales. Para ello se utilizó como modelo experimental raíces transformadas de Catharanthus roseus. Los resultados indican que en la fracción membranal y en la soluble, obtenidas de extractos de las raíces transformadas de C. roseus, se encuentran varias proteínas capaces de ser fosforiladas in Mitro empleando [32P]y-ATP. En la fracción membranal se detectaron fosfoproteínas con pesos moleculares entre 10 y 173 kDa, mientras que en la fracción soluble se detectaron fosfoproteínas con pesos moleculares entre 37 y 116 kDa. Al inmovilizar las proteínas fosforiladas en membranas de nylon y posteriormente ser tratadas con KOH, se observaron varias proteínas membranales resistentes al tratamiento alcalino, con pesos moleculares de 10, 18, 25, 40 y 55 kDa; por otro lado en la fracción soluble se detectó solamente una proteína resistente a este tratamiento, con un peso molecular de 63 kDa. También se observó que las proteínas membranales con pesos moleculares de 40, 55 y 173 kDa y las proteínas solubles con pesos moleculares de 43, 47, 63, 103 y 116 kDa, son reconocidas por anticuerpos monoclonales contra fosfotirosina, lo que indica que tales proteínas se fosforilan específicamente en residuos de tirosina. Con la finalidad de detectar posibles PTKs presentes en los extractos celulares, se caracterizó la capacidad de las fosfoproteínas de autofosforiiarse en residuos de tirosina. En la fracción soluble se observaron proteínas con pesos moleculares de 37, 43, 47, 63 y 72 kDa y en la fracción membranal proteínas con pesos moleculares de 35 y 40 kDa que dan señal positiva en un ensayo de fosforilación in situ. Este resultado sugiere que estas proteínas se autofosforilan en residuos de tirosina: Para comprobar la actividad de tirosina cihasa, los extractos membranal y soluble, fueron utilizados para determinar la capacidad de estas proteínas de fosforilar al péptido RR-SRC. Este péptido contiene en su secuencia un único sitio de fosforilación en un residuo de tirosina. El resultado de este experimento indicó que tanto la fracción membranal como la soluble presentan actividad de PTK. Asimismo, las actividades de PTK fueron inhibidas por genisteína, un inhibidor específico de algunas cinasas de tirosina.