Detección del fitoplasma causante de amarillamiento letal por medio de PCR en tiempo real usando una sonda Taqman para el gen groEL / Sandra Cecilia Ku Rodríguez

Tesis (Maestría en Ciencias Biológicas : Opción Biotecnología) .-- Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2011.

El Amarillamiento Letal (AL) es una enfermedad del cocotero y de otras palmas, causado por un patógeno conocido como fitoplasma Candidatus Phytoplasma palmae. El insecto vector es un fitófago conocido popularmente como "Chicharrita" (Myndus crudus); hasta la fecha no existe un control efectivo del AL, además de que los fitoplasmas no han podido ser cultivados in vitro lo que dificulta su estudio. La detección se realiza de manera indirecta mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en su modalidad de anidado que es una técnica sensible pero presenta inconvenientes como el tiempo requerido para realizarla debido a las dos rondas de amplificación, aunado a la posibilidad de obtener falsos positivos. En la actualidad se han desarrollado nuevas metodologías para detectar fitoplasmas entre ellas destaca el uso del PCR en tiempo real combinado con el uso de sondas TaqMan, que permite una detección rápida y sensible de patógenos de plantas. En el presente trabajo se diseño una sonda TaqMan específica para el gen groEL del fitoplasma del amarillamiento letal. Se realizó el diseño in silico de la sonda, de tal manera que se amplificó de manera específica al gen groEL; después de obtener el diseño de la sonda (L YgroEL) se implementaron los parámetros para llevar acabo en forma optima la PCR-tiempo real, la temperatura de alineación que se determinó fue de 61°C y se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.988. La sonda fue específica para la detección del fitoplasma de AL ya que no amplificó diferentes cepas de fitoplasmas. Se comparó su sensibilidad con el PCR anidado y los datos mostraron que la PCR en tiempo real con la sonda TaqMan fue más sensible. Se probó el uso de la sonda con 128 extractos de ADN de embriones provenientes de palmas infectadas y se obtuvo un 88 por ciento de positivos en comparación con el 8 por ciento cuando se utilizó PCR anidada para el gen groEL y no se obtuvieron positivos por medio de PCR anidada en el gen 165. El ensayo con PCR en tiempo real no amplificó en el ADN de embriones sanos. La detección del fitoplasma del AL en 137 extractos de ADN de insectos Myndus crudus por PCR-tiempo real fue de un 4 por ciento en comparación con el 1.5 por ciento de la PCR-anidada. Los resultados indican que la sonda es específica para la detección del fitoplasma de AL y más sensible que la PCR anidado.